PCR, е полимеразна верижна реакција, која се однесува на додавање на dNTP, Mg2+, фактори на издолжување и фактори за подобрување на засилувањето во системот под катализа на ДНК полимераза, користејќи ја матичната ДНК како шаблон и специфични прајмери како почетна точка на продолжување. Преку чекорите на денатурација, жарење, екстензија итн., процесот на ин витро репликација на ќеркичка ДНК комплементарна на шаблонот на матичната нишка на ДНК може брзо и конкретно да ја засили секоја целна ДНК ин витро.
1. Hot Start PCR
Почетното време на засилување кај конвенционалната PCR не е да се стави PCR машината во PCR машината, а потоа програмата почнува да се засилува.Кога ќе заврши конфигурацијата на системот, започнува засилувањето, што може да предизвика неспецифично засилување, а PCR со топол старт може да го реши овој проблем.
Што е Hot Start PCR?Откако ќе се подготви системот за реакција, ензимскиот модификатор се ослободува на висока температура (обично повисока од 90°C) за време на почетната фаза на загревање на реакцијата или фазата „топол почеток“, така што ДНК полимеразата се активира.Точното време и температура на активирање зависат од природата на ДНК полимеразата и модификаторот за топол старт.Овој метод главно користи модификатори како што се антитела, афинитетни лиганди или хемиски модификатори за да ја инхибираат активноста на ДНК полимеразата.Бидејќи активноста на ДНК полимеразата е инхибирана на собна температура, технологијата за топол старт обезбедува голема погодност за подготовка на повеќе системи за реакција на PCR на собна температура без да се жртвува специфичноста на PCR реакциите.
2. RT-PCR
RT-PCR (Обратна транскрипција PCR) е експериментална техника за обратна транскрипција од mRNA во cDNA и користење како шаблон за засилување.Експерименталната постапка е прво да се извлече вкупната РНК во ткивата или клетките, да се користи Oligo (dT) како прајмер, да се користи реверзна транскриптаза за синтетизирање на cDNA, а потоа да се користи cDNA како образец за PCR засилување за да се добие целниот ген или да се открие генската експресија.
3. Флуоресцентна квантитативна PCR
Флуоресцентна квантитативна PCR (Квантитативна PCR во реално време,RT-qPCR) се однесува на методот на додавање флуоресцентни групи во системот за реакција на PCR, со користење на акумулација на флуоресцентни сигнали за следење на целиот процес на PCR во реално време, и на крајот со користење на стандардната крива за квантитативна анализа на шаблонот.Најчесто користените qPCR методи вклучуваат SYBR Green I и TaqMan.
4. Вгнездени PCR
Вгнездена PCR се однесува на употреба на две групи на PCR прајмери за два круга на PCR засилување, а производот на засилување од вториот круг е целниот генски фрагмент.
Ако неусогласеноста на првиот пар прајмери (надворешни прајмери) предизвика засилување на неспецифичен производ, можноста истиот неспецифичен регион да биде препознаен од вториот пар прајмери и да продолжи да се засилува е многу мала, така што засилување со вториот пар на прајмери, специфичноста на PCR е подобрена.Една од предностите на изведувањето на два круга на PCR е тоа што помага да се засили доволен производ од ограничената почетна ДНК.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR е метод за подобрување на специфичноста на PCR реакцијата со прилагодување на параметрите на циклусот на PCR.
Во тачдаун PCR, температурата на жарење за првите неколку циклуси е поставена неколку степени над максималната температура на жарење (Tm) на прајмерите.Повисоката температура на жарење може ефикасно да го намали неспецифичното засилување, но во исто време, повисоката температура на жарење ќе го влоши одвојувањето на прајмерите и целните секвенци, што ќе резултира со намален принос на PCR.Затоа, во првите неколку циклуси, температурата на жарење обично се поставува да се намалува за 1°C по циклус за да се зголеми содржината на целниот ген во системот.Кога температурата на жарење е спуштена до оптималната температура, температурата на жарење се одржува за преостанатите циклуси.
6. Директен PCR
Директниот PCR се однесува на засилување на целната ДНК директно од примерокот без потреба од изолација и прочистување на нуклеинската киселина.
Постојат два типа на директна PCR:
директен метод: земете мала количина примерок и додајте ја директно во PCR Master Mix за PCR идентификација;
метод на крекирање: по земање мостри од примерокот, додајте го во лизатот, лизирајте за да се ослободи геномот, земете мала количина лизирана супернатант и додадете ја во PCR Master Mix, извршете PCR идентификација.Овој пристап го поедноставува експерименталниот работен тек, го намалува времето на работа и избегнува губење на ДНК за време на чекорите на прочистување.
7. SOE PCR
Спојувањето на гените со преклопување на PCR (SOE PCR) користи прајмери со комплементарни краеви за да направи PCR производите да формираат преклопувачки синџири, така што во последователната реакција на засилување, преку продолжувањето на преклопувачките синџири, различни извори на техниката А во која засилените фрагменти се преклопуваат и споени заедно.Оваа технологија моментално има две главни насоки на примена: изградба на гени за фузија;генска локација насочена мутација.
8. IPCR
Инверзната PCR (IPCR) користи обратни комплементарни прајмери за засилување на фрагменти на ДНК различни од двата прајмери, и засилува непознати секвенци од двете страни на познат ДНК фрагмент.
IPCR првично беше дизајниран да ја одреди секвенцата на соседните непознати региони и најчесто се користи за проучување на секвенците на генски промотори;онкогени хромозомски преуредувања, како што се фузија на гени, транслокација и транспозиција;и интеграција на вирусни гени, исто така најчесто се користат сега. За мутагенеза насочена кон локацијата, копирајте плазмид со саканата мутација.
9. dPCR
Дигитален PCR (dPCR) е техника за апсолутна квантификација на молекулите на нуклеинската киселина.
Во моментов постојат три методи за квантификација на молекулите на нуклеинската киселина.Фотометријата се заснова на апсорпција на молекулите на нуклеинската киселина;флуоресцентна квантитативна PCR во реално време (Real Time PCR) се заснова на вредноста на Ct, а вредноста на Ct се однесува на бројот на циклусот што одговара на вредноста на флуоресценцијата што може да се открие;дигитален PCR е најновата Квантитативна технологија базирана на метода на PCR со една молекула за броење квантификација на нуклеинска киселина е апсолутна квантитативна метода.
Време на објавување: Јуни-13-2023 година