Употреба и мерки на претпазливост на ултрафилтрациската центрифуга цевка
1) Изберете соодветна цевка за ултрафилтрација.Забележете дека UF мембраните се разликуваат по нивното ниво на толеранција на различни хемикалии.Вообичаено, цевките за ултрафилтрација со прекин на молекуларна тежина од 10 kDa може да се изберат со прекин на молекуларна тежина што не треба да биде поголем од 1/3 од молекуларната тежина на протеинот од интерес, како што е 35 kDa.Ако молекуларната тежина на протеинот од интерес е околу 10 kd, може да се користи цевка за ултрафилтрација со прекин на молекуларна тежина од 3 KD.
(2) Ултрафилтрацијата, свежо купена, е сува, со ултра чиста вода додадена пред употреба и вода целосно помината низ мембраната, ледената бања или фрижидерот претходно изладена неколку минути.Потоа се истура водата, т.е. протеинската течност, и колку се додава, кое и да не е повеќе од белата линија на врвот на цевката.Операцијата е лесна, а цевката за ултрафилтрација треба претходно да се излади на мраз пред да се додаде протеинскиот раствор.
3) И масата и центарот на гравитација требаше да ја достигнат рамнотежата.Забележете дека ротационата брзина и забрзувањето не се многу брзи, инаку директно ја оштетуваат ултрафилтрациската мембрана.Беше започната центрифугална ултрафилтрација (центрифугата претходно ладена на 4 степени).Откако RPM на различни центрифуги се претвори во g, беше различно.Забрзувањето на центрифугата беше прилагодено на минимум, намалувајќи го притисокот врз мембраната.Забелешка, не заборавајте да ја напуштите центрифугата откако центрифугата ќе ја достигне брзината на целта, или ако имате проблем, не можете да се справите со неа за прв пат.Ориентацијата на мембраната кон вретеното беше прилагодена според упатствата (аголната центрифуга е нормална мембрана на оската).Во практична употреба, општата брзина на ротација е помала од онаа во упатствата, така што може да се продолжи животниот век на цевката за центрифуга.
3) И масата и центарот на гравитација требаше да ја достигнат рамнотежата.Забележете дека ротационата брзина и забрзувањето не се многу брзи, инаку директно ја оштетуваат ултрафилтрациската мембрана.Беше започната центрифугална ултрафилтрација (центрифугата претходно ладена на 4 степени).Откако RPM на различни центрифуги се претвори во g, беше различно.Забрзувањето на центрифугата беше прилагодено на минимум, намалувајќи го притисокот врз мембраната.Забелешка, не заборавајте да ја напуштите центрифугата откако центрифугата ќе ја достигне брзината на целта, или ако имате проблем, не можете да се справите со неа за прв пат.Ориентацијата на мембраната кон вретеното беше прилагодена според упатствата (аголната центрифуга е нормална мембрана на оската).Во практична употреба, општата брзина на ротација е помала од онаа во упатствата, така што може да се продолжи животниот век на цевката за центрифуга.
(4) Кога ќе се концентрира на преостанатиот 1 ml, земете 50 ul пуфер раствор, додајте 10 ul проток и проверете дали има сина боја, како проценка дали на цевката за ултрафилтрација недостасува протеин.Ако цевката протекува, повторно истурете го горниот слој и протечете го во нова цевка за да започнете со ултрафилтрација.За прецизно да се утврди дали се пропуштени цевките, центрифугирајте 10 мин со 5 mg BSA пред протекување, работејќи на протеински лепак или брадфорд сурова анализа, и продолжете со додавање на преостанатиот концентриран протеински раствор (кој работи на мраз и го спречува загревањето на протеините) додека целиот концентрат е додаден.Внимавајте за време на центрифугирањето ако дојде до таложење на протеини, што доведува до затворање на цевката.Доколку дојде до врнежи, одреди дали специфичната причина за врнежите е прекумерна концентрација на протеини или несоодветен пуфер;Првото може да се реши со ултрафилтрација на повеќе цевки за ултрафилтрација истовремено, намалувајќи ја концентрацијата, а второто со размена на различни пуферски раствори додека не дојде до таложење на протеинот.
(4) Кога ќе се концентрира на преостанатиот 1 ml, земете 50 ul пуфер раствор, додајте 10 ul проток и проверете дали има сина боја, како проценка дали на цевката за ултрафилтрација недостасува протеин.Ако цевката протекува, повторно истурете го горниот слој и протечете го во нова цевка за да започнете со ултрафилтрација.За прецизно да се утврди дали се пропуштени цевките, центрифугирајте 10 мин со 5 mg BSA пред протекување, работејќи на протеински лепак или брадфорд сурова анализа, и продолжете со додавање на преостанатиот концентриран протеински раствор (кој работи на мраз и го спречува загревањето на протеините) додека целиот концентрат е додаден.Внимавајте за време на центрифугирањето ако дојде до таложење на протеини, што доведува до затворање на цевката.Доколку дојде до врнежи, одреди дали специфичната причина за врнежите е прекумерна концентрација на протеини или несоодветен пуфер;Првото може да се реши со ултрафилтрација на повеќе цевки за ултрафилтрација истовремено, намалувајќи ја концентрацијата, а второто со размена на различни пуферски раствори додека не дојде до таложење на протеинот.
(5) Првите неколку чекори се користат за концентрирање на протеинот, и ако пуферот треба да се смени, нежно додадете нов пуфер (ултрафилтрација преку ултрафилтрациона мембрана од 0,22 ум) на околу 1 ml вкупен протеин и повторно концентрирајте на околу 1 ml за три последователни пати, со конечниот концентриран конечен волумен во зависност од саканата концентрација на протеин, обично не повеќе од 500 ul, но исто така и до 200 ul.Постигнете 1000 × или повеќе во три наврати, во суштина онолку промени во тампонот, колку што се пресметува со барем 10 × или повеќе збогатување волумен секој пат.
(5) Првите неколку чекори се користат за концентрирање на протеинот, и ако пуферот треба да се смени, нежно додадете нов пуфер (ултрафилтрација преку ултрафилтрациона мембрана од 0,22 ум) на околу 1 ml вкупен протеин и повторно концентрирајте на околу 1 ml за три последователни пати, со конечниот концентриран конечен волумен во зависност од саканата концентрација на протеин, обично не повеќе од 500 ul, но исто така и до 200 ul.Постигнете 1000 × или повеќе во три наврати, во суштина онолку промени во тампонот, колку што се пресметува со барем 10 × или повеќе збогатување волумен секој пат.
Време на објавување: ноември-09-2022 година